母裂解酶-100T來自藤黃節桿菌（現貨促銷）

Zymolyase-100T From Arthrobacter luteus

-----MP Biomedicals New Zealand Limited

簡述：

 

   Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通過Arthrobacter luteus(藤黃節桿菌)深層培養獲得的酶制劑，它能有效的裂解活酵母細胞細胞壁。該制劑是利用親和層析法部分純化獲得的凍干酶，其酶活單位是100,000 單位/g.其中主要負責裂解活酵母細胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通過對ß-1,3-葡聚糖連接位水解葡萄糖聚合物，釋放產物主要是昆布五糖。

產品說明：

單位定義：800nm條件下菌液吸光度下降30%，表示一個活力單位。

特異性：此產品的裂解譜包括以下屬的生物：Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.

用途:可用于細胞裂解、原生質球形成及葡聚糖水解。

說明:酵母細胞的裂解程度隨酵母菌的種類、生長階段及培養條件而改變。

聲明: Zymolyase是麒麟麥酒股份有限公司（Kirin Brewery Co., Ltd）的注冊商標。

儲存:凍干狀態于2-8°C中保存，若30°C下放置3個月約失去90%活力。

外觀:凍干粉

活力：100,000單位/g

核心酶：ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶

其他酶: ß-1,3-葡聚糖酶，約1.0 x 10⁷ 單位 /g

         蛋白酶，約1.7 x 10⁴單位 /g

甘露聚糖酶, 約6.0 x 10⁴單位 /g

 淀粉酶，木聚糖酶，***酶，微量DNase及Rnase（未檢出）

催化劑：二硫蘇糖醇（DTT）, ß-巰基乙醇及其他的巰基化合物（如半胱氨酸）

最適pH及溫度：

     pH 7.5, 35°C裂解活酵母細胞

     pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖

pH范圍：pH 5-10間保持穩定

熱穩定性：60°C，5min喪失細胞溶解能力

警告：（1）Zymolase^Ø-100T溶解度低，以懸浮液的狀態使用。如果需制備濃度超過0.05%的無菌酶溶液，則通過將Zymolase^Ø-100T溶解在含5%葡萄糖的緩沖液中（pH 7.5），首先配制2%的酶儲存液；（2）吸取懸浮液，留下沉至容器管底的任何物質；（3）不推薦使用**纖維過濾器；（4）稀釋無菌的酶懸浮液至目標濃度。

原生質球制備程序：

 

1.      室溫條件，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養物；

2.      收集離心沉淀物（酵母細胞）并記錄濕重；

3.      用TE緩沖液懸浮細胞，加入量為1.4ml/g濕重細胞；（TE緩沖液配方：100 mM Tris [MP 8196231]，pH 8.0，100 mM EDTA [MP195173]）

4.      雙蒸水快速定容，終體積量為3.5ml/g濕重細胞；

5.      按照17.5 ul (總體積的1/200)/ g濕重細胞的量加入ß -巰基乙醇（MP 806445），目的是為了除去細胞外層中的甘露聚糖層；

6.      30°C輕搖溫育混合液，處于對數期生長的培養物處理15min，處于穩定期生長的培養物處理45min；

7.      室溫條件，5000rpm離心5min；

8.      用S緩沖液重新懸浮細胞，加入量為4.0ml/g濕重細胞；（S緩沖液配方：1.0 M 山梨糖[MP 102938]，10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5）

9.      5000rpm離心5min；

10.   再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細胞）懸浮細胞，另外加入Zymolyases（50U /g濕重細胞）；如果Zymolyases配制成附錄所示的溶液，則添加250ul即可。最好根據實驗情況最先優化酶使用量。

11.   30°C輕搖溫育混合液30min，根據以下方式監測原生質球形成程度：

（1）         加1ul樣品到20ul S 緩沖液內，原生質球應該保持完整；

（2）         加1ul樣品到20ul雙蒸水中，原生質球應該破裂；顯微鏡下觀察比較兩個樣品的形態差異。

12．一般情況下反應45-60min，原生質球的形成量>90%，此時4^oC下離心收集細胞，5000rpm，5min；

13. 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細胞）懸浮原生質球，5000rpm離心5min；重復此步驟做第二次清洗；；

14.原生質球離心沉淀物-70^oC凍存。

裂解原生質球獲取細胞核：

   溫和的裂解原生質球方法如下; 用3倍體積的18%Ficoll（MP 160003）溶液懸浮細胞離心沉淀物，Ficoll溶解于含有0.5 mM CaCl₂ (MP 195088)的10 mM PIPES 緩沖液內，pH 6.5。

酵母菌基因組DNA的制備：

 以下步驟快捷，適合于從少量酵母培養物中制備基因組DNA ：

1.     將過夜培養的10ml酵母菌培養物離心收集細胞，加入280ul TE Buffer（配方見原生質球制備程序中的步驟3），300 ul雙蒸水，3 ul ß -巰基乙醇（MP 806445）；

2.     30^oC溫育45min；

3.     以臺式離心機的最高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀物用500 ul S 緩沖液（配方見原生質球制備程序中的步驟8）懸浮.；再次離心棄上清；

4.     用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T（MP 32-092-1）的S緩沖液懸浮細胞沉淀物（或者使用自己認為最合適的酶濃度）；

5.     30^oC溫育1小時；

 

6.     重復步驟3；

7.     用200 ul含有0.1%SDS（MP 190522）和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 緩沖液懸浮細胞沉淀物；

8.     37^oC溫育3小時，不時的混勻溶液；

9.     調水浴鍋的溫度至65^oC，并溫育20min；

10. 從水浴鍋內取出并冷卻至室溫；

11. 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從離心機內取出并保留上清液；

12. 用200ul氯仿萃取上清液，之后重復漩渦混勻及離心；

13. 加入500ul95%乙醇到上清液內，20^oC沉淀10min；

14.  4^oC下，15,000 xg離心20 min；

15. 自然風干或者于真空離心蒸發濃縮器內晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A (MP 101076)）溶解DNA;

16.  37^oC溫育1小時；

17. 重復步驟11和12；

18. 加入2.5倍體積的95%乙醇，20^oC沉淀10min；

19.  30ul雙蒸水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A₂₆₀，根據消光系數計算DNA產量；

20. 產量大約為40-50ug。

附錄:

制備Zymolyase 100T溶液：

以下配制的溶液適用于該產品的實驗程序中（但并不排除其他類型的母液也適用）

配制200單位/ml的母液，將凍干粉溶于已高壓滅菌的S緩沖液（配方見原生質球制備程序中的步驟8）。

如果不被微生物污染，于4 ^oC下，此母液能2個星期以上時間內保持高效；

參考文獻：

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08320921	320921	Zymolyase 20T	1 g	3841.00
08320931	320931	ZYMOLYASE 100T	500 mg	16128.00
08320932	320932	ZYMOLYASE 100T	250 mg	9898.00

 

廠家說明：

MP Biomedicals生物醫學公司是位于美國加利福尼亞州的知名生命科學和生物技術廠商。2004年底成功收購Qbiogene、ICN，現在全球有5個大型倉庫，能夠及時供應各行業需求，亞洲倉庫位于新加坡。它致力于生命科學領域的基礎研究和探索。目前它提供55000多種產品，是世界上能全面提供生命科學產品和臨床診斷產品的幾家廠商之一。

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