Sephadex LH20的分離原理是根據分子大小，主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，最后出柱（具體原理可參見分子篩層析）。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。