MALBAC技術(shù)是由北京大學(xué)生物動(dòng)態(tài)光學(xué)成像中心(BIOPIC)主任、哈佛大學(xué)終身教授、美國(guó)科學(xué)院院士謝曉亮領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)發(fā)明。他們的工作不僅大大拓展了單細(xì)胞基因組學(xué)研究技術(shù)，而且給現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶來(lái)了革命性的突破，是“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”的一個(gè)最佳范例 。
通過(guò)與BIOPIC的湯富酬教授團(tuán)隊(duì)、北京大學(xué)第三醫(yī)院院長(zhǎng)喬杰團(tuán)隊(duì)的合作，2014年下半年，兩對(duì)攜帶遺傳疾病致病基因的夫婦在MALBAC技術(shù)的幫助下成功生下了健康的嬰兒。此外，MALBAC技術(shù)還正在用于探索針對(duì)腫瘤患者的個(gè)體化診斷和治療方案。
2015年7月18日，謝曉亮應(yīng)邀在“未來(lái)論壇”上發(fā)表題為“單分子水平上的生命——通往精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)之路”的演講，回顧并展望了他在單分子基因組學(xué)上的基礎(chǔ)研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的探索之路。
北京大學(xué)生命科學(xué)院饒毅教授在現(xiàn)場(chǎng)介紹他時(shí)說(shuō)：“謝曉亮的第一個(gè)基礎(chǔ)研究工作是1998年開(kāi)展的單分子酶學(xué)，他開(kāi)創(chuàng)了在單分子層面對(duì)生命過(guò)程的研究。近年他又開(kāi)始探索在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。中國(guó)引進(jìn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)后，在現(xiàn)代藥學(xué)方面只有少數(shù)幾個(gè)藥物作用領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)上唯一的發(fā)明和應(yīng)用就是謝曉亮和湯富酬、喬杰三個(gè)團(tuán)隊(duì)合作誕生的‘MALBAC嬰兒’。”
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院院長(zhǎng)曹雪濤認(rèn)為，謝曉亮的MALBAC技術(shù)能夠改變整個(gè)生物醫(yī)學(xué)，其對(duì)未來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用的貢獻(xiàn)是不可限量的。
“獲得終身教授的人很多，但真正能夠在人類(lèi)歷史上，特別是科技史上留下印記的科學(xué)家非常少見(jiàn)，而謝曉亮將理論和技術(shù)結(jié)合，用技術(shù)解決科學(xué)問(wèn)題，是引領(lǐng)整個(gè)科學(xué)界發(fā)展的真正的一流科學(xué)家。”曹雪濤評(píng)價(jià)說(shuō)：“他是一個(gè)讓你無(wú)法預(yù)知將來(lái)還會(huì)做出什么創(chuàng)造性工作的科學(xué)家。這是一個(gè)科學(xué)家具有潛在創(chuàng)造力、影響力、引領(lǐng)力的標(biāo)志。”
以下是根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)錄音和演講PPT整理的演講全文，全文已由謝曉亮教授審閱。
女士們、先生們：
我今天的講座內(nèi)容跨度會(huì)比較大，從物理學(xué)到化學(xué)、到生物、到醫(yī)學(xué)。
著名的物理學(xué)家理查德?費(fèi)曼(Richard Feynman)曾經(jīng)說(shuō)過(guò)：“如果要用一句話(huà)來(lái)描述我們擁有的最重要的科學(xué)知識(shí)，這句話(huà)應(yīng)該是：所有物質(zhì)都是原子組成。”原子在宇宙中比比皆是，但是如果只有獨(dú)立的原子，我們的世界會(huì)變得非常無(wú)趣，沒(méi)有生命、沒(méi)有愛(ài)。原子間的相互作用導(dǎo)致分子的產(chǎn)生，分子們進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生新的分子，這才有了生命。
那么如果要用一句話(huà)來(lái)形容過(guò)去半個(gè)多世紀(jì)生命科學(xué)的主要進(jìn)展，這句話(huà)應(yīng)該是什么?我想應(yīng)該是：生命過(guò)程可以在分子水平上得到解釋。
單分子成像技術(shù)開(kāi)啟研究生涯
我在北大讀本科時(shí)學(xué)的是化學(xué)，生物是到美國(guó)才學(xué)的。我1985年離開(kāi)北大，來(lái)到美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校，攻讀物理化學(xué)博士學(xué)位。我因從小就喜歡動(dòng)手，在美國(guó)學(xué)的是用超快激光來(lái)研究化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
在化學(xué)和生物化學(xué)的教科書(shū)里，分子相互作用和化學(xué)反應(yīng)總是在單分子的水平上描述的，可是迄今為止，我們的化學(xué)知識(shí)幾乎都是從含有大量分子的實(shí)驗(yàn)中得到的，量大到摩爾(mole)的數(shù)量級(jí)。1摩爾是2克氫分子的分子數(shù)目，被稱(chēng)作“阿伏伽德羅常數(shù)”。阿伏伽德羅是意大利的化學(xué)家、物理學(xué)家，雖然他定義了阿伏伽德羅常數(shù)，但他只知道這是一個(gè)非常大的數(shù)，直到死也不知道到底是多大。現(xiàn)在我們知道，阿伏伽德羅常數(shù)是6.023x1023，這是個(gè)天文數(shù)字，我估算了一下，1摩爾1立方毫米的沙子，如果平鋪在中國(guó)大地上，可以形成一個(gè)60米深的沙漠。
90年代初，我在美國(guó)太平洋西北國(guó)家實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始了我的獨(dú)立研究生涯，帶領(lǐng)一個(gè)團(tuán)隊(duì)研究在常溫下用熒光來(lái)檢測(cè)單個(gè)分子(見(jiàn)上圖)。當(dāng)時(shí)的研究非常令人興奮，有幾個(gè)小組在競(jìng)爭(zhēng)，去年因?yàn)槌直媛薀晒怙@微技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的兩位科學(xué)家Eric Betzig和W.E. Moerner那時(shí)也在做同樣的事。1994年7月，我第一次在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了文章，研究單分子的動(dòng)態(tài)過(guò)程。在此前的研究生和博士后階段，我還沒(méi)在《科學(xué)》或《自然》雜志上發(fā)表過(guò)文章。
這篇文章是和我的第一個(gè)博士后Bob Dunn合作的。當(dāng)我們把這些技術(shù)發(fā)展起來(lái)以后，我有了一個(gè)預(yù)感，單分子技術(shù)在生物化學(xué)和分子生物學(xué)上將有重要的應(yīng)用。所以我們就開(kāi)始研究酶。
酶是生物過(guò)程的催化劑，加速生物化學(xué)的反應(yīng)。我們把帶有熒光的膽固醇氧化酶分子固定在99%的瓊膠中，讓它們不能游動(dòng)，以便我們長(zhǎng)時(shí)間地觀察膽固醇酶催化的膽固醇氧化反應(yīng)。
這個(gè)酶有兩個(gè)態(tài)，在氧化態(tài)下，它有天然的熒光，在還原態(tài)下，它不會(huì)發(fā)光。酶作為生物催化劑，它在這兩個(gè)態(tài)之間循環(huán)，自己最后是沒(méi)有變化的。所以當(dāng)我們觀測(cè)單個(gè)酶分子的熒光時(shí)，每一次熒光的“亮/滅”就對(duì)應(yīng)著一個(gè)酶分子催化狀態(tài)的循環(huán)。這使我們第一次實(shí)時(shí)觀測(cè)到了單個(gè)酶分子的化學(xué)反應(yīng)。在單分子層面上，化學(xué)反應(yīng)是隨機(jī)發(fā)生的，即化學(xué)反應(yīng)發(fā)生所需的等待時(shí)間是隨機(jī)分布的，而不像在擁有大量分子系統(tǒng)中的反應(yīng)里，有可被推測(cè)的結(jié)果。因此單個(gè)酶分子的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線是不會(huì)在下一個(gè)實(shí)驗(yàn)中重復(fù)出現(xiàn)的，盡管這個(gè)曲線的統(tǒng)計(jì)結(jié)果是可以重復(fù)的。
因?yàn)檫@個(gè)工作，哈佛大學(xué)給了我一個(gè)資深教授的職位。這個(gè)工作之所以重要，是因?yàn)楹芏嗌锎蠓肿樱热鏒NA是以單分子或者少量幾個(gè)分子的形式存在于細(xì)胞之中的，這個(gè)工作讓人們能對(duì)單分子的生物化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。
大家知道，20世紀(jì)最重要的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)是沃森(Watson)和克里克(Crick)解出遺傳分子DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA是由四種堿基(A、T和C、G)配對(duì)構(gòu)成的。遺傳信息儲(chǔ)存在堿基的序列里。
單分子酶學(xué)也具有實(shí)際應(yīng)用意義。比如有人做了與我們類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，造出了兩個(gè)單分子DNA測(cè)序儀，其中一個(gè)美國(guó)加州的公司做的Pacbio測(cè)序儀,通過(guò)監(jiān)測(cè)單個(gè)合成DNA的酶分子，將有熒光標(biāo)記的四個(gè)堿基逐個(gè)加入到DNA模版上，以直接讀取DNA分子的序列。這個(gè)技術(shù)的特點(diǎn)是它能夠測(cè)很長(zhǎng)的DNA序列。
在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，單分子生物學(xué)增進(jìn)了我們對(duì)許多生物大分子工作機(jī)理的深入了解，讓我們?cè)诨罴?xì)胞里直接觀測(cè)蛋白質(zhì)分子的逐個(gè)產(chǎn)生。分子生物學(xué)的中心法則告訴我們，在DNA上的遺傳基因會(huì)轉(zhuǎn)錄成mRNA，在翻譯過(guò)程中mRNA導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成。
由于一個(gè)基因在單個(gè)活細(xì)胞里只有1到2個(gè)拷貝，基因表達(dá)過(guò)程就跟單個(gè)酶分子反應(yīng)一樣，也是隨機(jī)發(fā)生的，所以單分子生物學(xué)與單細(xì)胞生物學(xué)是密切相關(guān)的。我們對(duì)單個(gè)活細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了非常詳細(xì)的研究，從而使得分子生物學(xué)的中心法則得到了定量的描述。
上圖右邊的機(jī)體細(xì)胞有同樣的基因和基因組，我們說(shuō)它有同樣的基因型，但它們有不同的表型，一個(gè)有熒光，一個(gè)沒(méi)有熒光。這個(gè)細(xì)胞從一個(gè)表型變到另外一個(gè)表型，從沒(méi)有熒光的狀態(tài)變到有熒光的狀態(tài)，可以證明這個(gè)過(guò)程完全是由于單個(gè)蛋白質(zhì)分子從DNA的單鏈上隨機(jī)脫落下來(lái)造成的。我覺(jué)得這是一個(gè)非常普遍的現(xiàn)象，單分子的小概率事件可以導(dǎo)致非常重要的生物學(xué)結(jié)果。
基因突變也是這樣。這個(gè)基因型和表型的關(guān)系跟我生活中最大的奧秘是相連的，我的兩個(gè)女兒是同卵雙胞胎。同卵雙胞胎被普遍認(rèn)為有相同的基因組，我的雙胞胎女兒確實(shí)非常相似，但她們有各自的特點(diǎn)，也許這跟基因表達(dá)的隨機(jī)性是相關(guān)的。最近有研究表明，同卵雙胞胎的基因組實(shí)際上是不一樣的，因?yàn)槲覀兊幕蚨际请S時(shí)間變化的。不管怎么說(shuō)，基因型和表型的關(guān)聯(lián)是生物學(xué)中非常重要的一個(gè)問(wèn)題。
破解基因組的奧秘
生物遺傳學(xué)起源于孟德?tīng)柕倪z傳法則。孟德?tīng)柺且晃荒翈煟膫ゴ笫侨ナ乐蟛疟蝗藗冋J(rèn)可的。幾個(gè)月前，我應(yīng)邀在捷克斯洛伐克給了一個(gè)“孟德?tīng)栔v座”，有幸在他曾經(jīng)工作過(guò)的修道院(見(jiàn)下圖)做了報(bào)告。
(右圖是孟德?tīng)柗N植豌豆的田地，其上是他的雕像)
孟德?tīng)柕膶?shí)驗(yàn)(見(jiàn)上圖左圖)是把綠色的豌豆和黃色的豌豆雜交，開(kāi)始是用純種豌豆雜交，雜交的結(jié)果還是綠色的，后來(lái)他把兩個(gè)雜交出的綠豌豆再次雜交，就發(fā)現(xiàn)有1/4的幾率可以得到黃色的豌豆。通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，他推斷每個(gè)豌豆有2個(gè)等位基因，分別來(lái)源于上一代，一個(gè)是顯性基因(綠色)，一個(gè)是隱性基因(黃色)。
后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)也遵循類(lèi)似的遺傳法則。人的體細(xì)胞與豌豆一樣，正常情況下都是雙倍體，有46條染色體，其中23條來(lái)自父親，23條來(lái)自母親。染色體存在于細(xì)胞核內(nèi)，是46條不同的DNA分子。它們有60億對(duì)堿基，攜帶2萬(wàn)個(gè)基因。(編者注：人類(lèi)基因組由30億對(duì)堿基構(gòu)成，分布于23條獨(dú)立的染色體中。人類(lèi)的體細(xì)胞是雙倍體含有46條染色體，生殖細(xì)胞是單倍體，含有23條染色體。體細(xì)胞中的兩套染色體分別源于父親和母親，它們所包含的堿基有微小的差異，因此人的全基因組包括約60億對(duì)堿基)。
基因組的主要變化是點(diǎn)突變(SNV)和基因拷貝數(shù)的變化( CNV)。我們每個(gè)人之間的不同就是由于點(diǎn)突變，也就是單堿基發(fā)生了變化。60億對(duì)堿基中大約只有千分之一的堿基在人與人之間是不同的。另外一個(gè)基因組產(chǎn)生變化的是基因拷貝數(shù)的變化(CNV)。一般來(lái)講，基因拷貝數(shù)應(yīng)該是2，一個(gè)來(lái)自于父親，一個(gè)來(lái)自于母親，形成兩個(gè)等位基因。但有的時(shí)候，特別是發(fā)生癌癥的時(shí)候，拷貝數(shù)可以變成1，3或者4，這叫染色體不正常。
2001年人類(lèi)基因組計(jì)劃完成，也就是這30億對(duì)堿基的順序被測(cè)定了，這是人類(lèi)歷史上的一個(gè)里程碑，意義重大。當(dāng)時(shí)美國(guó)的一個(gè)私人公司(領(lǐng)導(dǎo)人是Craig Venter)和美國(guó)組織的國(guó)際團(tuán)隊(duì)(領(lǐng)導(dǎo)人是現(xiàn)任美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生局主任Francis Colon)展開(kāi)了激烈的競(jìng)爭(zhēng)，他們分別在《科學(xué)》雜志和《自然》雜志上發(fā)表文章。這項(xiàng)工作花了30多億美金，用的方法是第一代電泳技術(shù)。這是1980年獲得諾貝爾獎(jiǎng)的技術(shù)，是由Fred Sanger(1918-2013)做出的。這是一個(gè)傳統(tǒng)的辦法，通過(guò)測(cè)DNA的長(zhǎng)短來(lái)測(cè)序。
以這個(gè)技術(shù)為基礎(chǔ)研發(fā)的第一代測(cè)序儀由美國(guó)公司ABI生產(chǎn)，該產(chǎn)品是產(chǎn)學(xué)研結(jié)合的范例。加州理工學(xué)院的教授Leroy Hood和他的研究生Mike Hunkapiller先在他們的實(shí)驗(yàn)室里改造了傳統(tǒng)的 DNA測(cè)序方法，把電泳的方法用到毛細(xì)管里，用激光來(lái)代替放射性DNA監(jiān)測(cè)儀，然后成立了ABI公司。這是一家車(chē)庫(kù)公司，但后來(lái)這家公司很快壟斷了世界測(cè)序儀市場(chǎng)。剛才說(shuō)的參與人類(lèi)基因組計(jì)劃測(cè)序競(jìng)爭(zhēng)的私人公司領(lǐng)導(dǎo)人Craig Venter就是買(mǎi)了250臺(tái)這種儀器來(lái)完成的人類(lèi)基因組的測(cè)序。
Craig Venter的一大科學(xué)貢獻(xiàn)是把人類(lèi)的基因庫(kù)組裝起來(lái)，他發(fā)明的方法是很有意思的“鳥(niǎo)槍法”。比如說(shuō)我要知道《三國(guó)演義》這本書(shū)里文字的序列，但是我能得到的只是打碎的一行一行的片段。Venter的方法是找很多本《三國(guó)演義》，然后打碎成一行一行的，由于是隨機(jī)的，所以每行的斷裂都不一樣，然后把得到的千千萬(wàn)萬(wàn)碎片上下重疊起來(lái)，就可以得到《三國(guó)演義》中原始的文字序列(見(jiàn)下圖)。當(dāng)時(shí)沒(méi)有人覺(jué)得這個(gè)方法可行，而Venter堅(jiān)信可以由此得到百分之八、九十的人類(lèi)基因序列，雖然不是100%，但已經(jīng)很了不起了。
如今十幾年過(guò)去了，測(cè)序儀技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。2007年以來(lái)，新一代的DNA測(cè)序儀層出不窮，主要是因?yàn)镃CD(電荷耦合元件)的應(yīng)用，使得大家可以在很多不同的位置上觀測(cè)大量的序列，提高測(cè)序通量，這樣一來(lái)，測(cè)序價(jià)格的衰減比指數(shù)衰減還快。現(xiàn)在如果你想測(cè)你的基因組，一天之內(nèi)就可以完成，價(jià)格大概1000美金。其中Illumina公司的儀器占據(jù)了90%的市場(chǎng)。第三代測(cè)序儀是單分子測(cè)序儀，但它現(xiàn)在在成本、準(zhǔn)確性和通量方面還不能與基于大量分子的DNA測(cè)序儀相競(jìng)爭(zhēng)。
我的哈佛實(shí)驗(yàn)室也做過(guò)一個(gè)測(cè)序儀，但是我們起步比較晚，這是因?yàn)榈焦鹨院笠獙W(xué)怎么做教授，怎么教書(shū)，怎樣申請(qǐng)基金。 我們只發(fā)表了一篇文章，沒(méi)形成產(chǎn)品。中國(guó)目前還沒(méi)有自己的測(cè)序儀，但就像中國(guó)需要自己的飛機(jī)一樣，中國(guó)也需要自己的測(cè)序儀。這幾年我和北大的黃巖誼教授一直在合作做這個(gè)工作。
哈佛實(shí)驗(yàn)室的新發(fā)明
新一代測(cè)序儀對(duì)醫(yī)學(xué)的貢獻(xiàn)是革命性的，它使個(gè)體化醫(yī)療成為可能。什么是個(gè)體化醫(yī)療?就是通過(guò)個(gè)人的基因組測(cè)序，為預(yù)防、檢測(cè)和治療疾病提供個(gè)體化的解決方案，所以基因測(cè)序成為了個(gè)體化醫(yī)療的基礎(chǔ)。
一個(gè)著名的例子是，美國(guó)好萊塢影星安吉麗娜?茱莉公開(kāi)宣布她切除了乳房，因?yàn)樗雷约簲y帶一個(gè)有缺陷的基因BRAC1，她的醫(yī)生估算過(guò)，她有87%的幾率患乳腺癌，50%的幾率患卵巢癌。她宣布切除乳房的這一天，是2013年5月13日，當(dāng)時(shí)我正好在美國(guó)衛(wèi)生局進(jìn)行一個(gè)申請(qǐng)項(xiàng)目的答辯。我的實(shí)驗(yàn)室有一種技術(shù)，可以讓父母避免把嚴(yán)重的遺傳病遺傳給胎兒。評(píng)審委員會(huì)聽(tīng)到朱莉的新聞后就問(wèn)我，如果把我的技術(shù)用來(lái)避免把有缺陷的基因遺傳給下一代，倫理上行不行?我當(dāng)時(shí)還沒(méi)想好，結(jié)果這個(gè)項(xiàng)目沒(méi)有在美國(guó)啟動(dòng)。關(guān)于倫理問(wèn)題，我到今天也沒(méi)有一個(gè)好的答案。但我今天想告訴大家，我們這兩年在北京大學(xué)的一個(gè)工作，是倫理上可以接受的。
這個(gè)新技術(shù)對(duì)我來(lái)講是一個(gè)新的單分子實(shí)驗(yàn)。如果給我一個(gè)人的體細(xì)胞，我能告訴你這個(gè)人的基因組，就是46條染色體的序列是什么樣的。
我們以前是測(cè)多細(xì)胞的，抽10毫升血來(lái)測(cè)。那么我們?yōu)槭裁匆獪y(cè)單細(xì)胞的基因組?因?yàn)橛捎诜N種原因，基因組對(duì)每個(gè)細(xì)胞來(lái)講都不相同。比如說(shuō)人類(lèi)生殖細(xì)胞(精子、卵子)在分裂時(shí)發(fā)生隨機(jī)重組，使得每個(gè)生殖細(xì)胞都不相同。另外癌細(xì)胞中劇烈的基因組變化，也使得原發(fā)腫瘤中的細(xì)胞之間存在高度不同。
剛才說(shuō)到在一個(gè)細(xì)胞中最常見(jiàn)的基因組改變包括點(diǎn)突變和基因拷貝數(shù)變化。這種變化是單分子的變化，所以是隨機(jī)的，不同細(xì)胞是不同步的，不知道它什么時(shí)候發(fā)生，也不知道它在哪發(fā)生，因此每個(gè)細(xì)胞都擁有不同的基因組，這使得單細(xì)胞測(cè)序成為必須。只不過(guò)以前技術(shù)上不可行。到目前為止，還沒(méi)有一臺(tái)單分子測(cè)序儀可以把46條染色體從頭測(cè)到尾進(jìn)行測(cè)序，我們必須借助于單細(xì)胞基因組的擴(kuò)增，就是把46條染色體放大，然后進(jìn)行高通量的測(cè)序。
第一種方法是PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)，這是一個(gè)在1985年獲得諾貝爾獎(jiǎng)的技術(shù)，有單拷貝的高靈敏度。在犯罪現(xiàn)場(chǎng)，只要拿到一個(gè)DNA分子，我們就可以把信號(hào)放大到被檢測(cè)的點(diǎn)。但是如果用它來(lái)覆蓋全基因組，指數(shù)放大覆蓋率只有6%。因?yàn)镻CR技術(shù)是指數(shù)放大，讓一個(gè)DNA變成兩個(gè)，兩個(gè)變成四個(gè)。這種指數(shù)放大過(guò)程不夠精確，因?yàn)樗菍?duì)拷貝進(jìn)行拷貝，一旦拷貝件出錯(cuò)，錯(cuò)誤就會(huì)被傳下去，結(jié)果就不準(zhǔn)了。
2012年，我在哈佛的實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了新的單細(xì)胞擴(kuò)增方法——“多重退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增法”(MALBAC)。它的最大優(yōu)勢(shì)是線性擴(kuò)增，而不是指數(shù)擴(kuò)增，不針對(duì)DNA拷貝再做拷貝，我們只拷貝原始DNA。就像一臺(tái)復(fù)印機(jī)把原始的一份文件復(fù)制成多份，如果一次復(fù)制出錯(cuò)的話(huà)，在擴(kuò)增后的產(chǎn)物里是微不足道的。哪怕單個(gè)細(xì)胞的30億個(gè)堿基對(duì)里有一個(gè)堿基錯(cuò)了，我們都能看出來(lái)，而且沒(méi)有假陽(yáng)性。這種方法比此前廣泛應(yīng)用的MDA(多重置換擴(kuò)增)方法能更準(zhǔn)確地檢測(cè)SNV(點(diǎn)突變)和CNV(拷貝數(shù)變異)，將覆蓋率大大提高到了93%。
做出這個(gè)工作的是我哈佛實(shí)驗(yàn)室的博士后宗誠(chéng)航和我當(dāng)時(shí)的博士研究生陸思嘉。目前，宗誠(chéng)航正在 Baylor College of Medicine 做助理教授。陸思嘉在哈佛的博士論文就是關(guān)于MALBAC技術(shù)。他想看到他畢業(yè)論文的社會(huì)效應(yīng)，所以?xún)赡昵盎貒?guó)跟我創(chuàng)立了做單細(xì)胞測(cè)序的公司——億康基因。他目前擔(dān)任億康基因的CTO。
我們當(dāng)時(shí)做的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)就是測(cè)單個(gè)精子的序列。精子作為生殖細(xì)胞，是單倍體，有23條染色體，其中一半基因來(lái)自父親，一半基因來(lái)自母親。
如圖所示，綠的是父源DNA，紅的是母源DNA，每條染色體都是父源和母源基因的組合。由于基因組合交結(jié)的地方不一樣，所以每個(gè)精子的序列都是不一樣的。這就是為什么兄弟姐妹都不一樣。
這項(xiàng)工作是與我以前BIOPIC的同事李瑞強(qiáng)教授合作的。精子來(lái)源于一位華人教授，我們檢測(cè)了他的99個(gè)精子，發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)染色體不正常的精子細(xì)胞，其中一個(gè)缺第19號(hào)染色體，一個(gè)6號(hào)染色體出現(xiàn)了2個(gè)拷貝。好在這個(gè)人還算正常，因?yàn)槿魏我粋€(gè)正常的男子都會(huì)有～5%的精子出現(xiàn)拷貝數(shù)不正常的現(xiàn)象。這種不正常是由于細(xì)胞分裂時(shí)染色體沒(méi)有正常分裂。這種染色體不正常的精子會(huì)導(dǎo)致生殖障礙、流產(chǎn)、胚胎停育或者唐氏綜合癥等遺傳疾病，盡管父母看起來(lái)完全健康，但就是有5%的出錯(cuò)幾率。對(duì)男子而言，這5%的幾率是不隨年齡變化而變化的。但對(duì)女士的卵子來(lái)講，染色體不正常的幾率在30歲之前是25%，此后很快隨年齡的增長(zhǎng)而上升，到40歲的時(shí)候是70%。這就導(dǎo)致發(fā)生生殖障礙的比率和流產(chǎn)的比率隨年齡的增長(zhǎng)而增加，生育成功率則隨年齡的增長(zhǎng)而遞減。
利用MALBAC技術(shù)，我們可以選擇一個(gè)染色體正常的受精卵來(lái)提高生育成功率，特別是對(duì)高齡產(chǎn)婦。這是可能的，因?yàn)樗齻內(nèi)旧w不正常的幾率并不是100%，即使在43歲以后，婦女仍然有正常的卵細(xì)胞，只不過(guò)幾率小一些。即使是50多歲的婦女，只要有一個(gè)染色體正常的受精卵，不管是本人的還是別人捐獻(xiàn)的，她懷孕的成功率就和年輕婦女一樣。也就是說(shuō)有一個(gè)好的卵子是正常生育的前提條件。
中國(guó)是一個(gè)人口大國(guó)，出生缺陷率高，遺傳疾病患者多，大概有1%。不孕不育的夫婦也越來(lái)越多,高達(dá)育齡夫婦的10%，全國(guó)大約有一千萬(wàn)對(duì)育齡夫婦存在不孕不育問(wèn)題，漸漸成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，此外，隨著現(xiàn)代化進(jìn)程的推進(jìn)，頭胎生育年齡逐漸增加，這個(gè)問(wèn)題也會(huì)日益嚴(yán)重。不孕不育和遺傳疾病不僅為患者個(gè)人帶來(lái)了巨大的痛苦，也大大增加了家庭、社會(huì)與政府的負(fù)擔(dān)。
MALBAC寶寶的誕生
世界上第一個(gè)試管嬰兒誕生于1978年，迄今已有超過(guò)600萬(wàn)個(gè)孩子是通過(guò)試管嬰兒技術(shù)出生的。Robert Edwards是試管嬰兒的創(chuàng)始人，他于2013年去世了。然而直到他去世前兩年，也就是2010年才榮獲諾貝爾獎(jiǎng)，并獲得爵士封號(hào)。可以想象他當(dāng)年的研究工作困難有多大，絕不僅僅是技術(shù)上的困難。
中國(guó)第一個(gè)試管嬰兒于1988年在北醫(yī)三院誕生，由張麗珠教授完成，她是現(xiàn)在北醫(yī)三院院長(zhǎng)、著名婦產(chǎn)科醫(yī)生喬杰教授的導(dǎo)師。當(dāng)時(shí)張教授比Edwards晚了10年，而這次喬杰院長(zhǎng)走在了世界的前列。為了將單細(xì)胞基因組學(xué)在生殖醫(yī)學(xué)中進(jìn)行應(yīng)用，我和喬杰院長(zhǎng)、湯富酬教授，還有億康基因公司展開(kāi)合作。湯富酬是北京大學(xué)“生物動(dòng)態(tài)光學(xué)成像中心”(BIOPIC)的一位年輕有為的科學(xué)家，BIOPIC成立于2010 年，致力于技術(shù)推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)的研究。作為BIOPIC的主任，在過(guò)去的幾年里，我不斷往返于北大和哈佛之間。我們的合作是怎么開(kāi)始的呢?我當(dāng)時(shí)需要一份精子活力的報(bào)告，找到喬院長(zhǎng)幫忙，喬院長(zhǎng)了解我們的技術(shù)以后，就說(shuō)你可別光研究精子，一定要研究卵子，因?yàn)檠芯颗艘妊芯磕腥擞幸馑嫉枚唷?010年，我們的“北京大學(xué)生物動(dòng)態(tài)光學(xué)成像中心”(BIOPIC)成立了，立志于用技術(shù)推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)的研究。
我們要做的實(shí)驗(yàn)是對(duì)單個(gè)人卵細(xì)胞進(jìn)行高精度的全基因組測(cè)序分析。下圖是一個(gè)卵母細(xì)胞，里面有兩根DNA是從父親來(lái)的，兩根DNA是從母親來(lái)的。剛才講過(guò)，基因在重組時(shí)的交結(jié)點(diǎn)不一樣，使得每個(gè)卵子和精子都不同。卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，會(huì)在旁邊產(chǎn)生一個(gè)第一極體和第二極體作為卵細(xì)胞減數(shù)分裂的產(chǎn)物，它們分別是雙倍體和單倍體，這兩個(gè)極體細(xì)胞是沒(méi)有用的，會(huì)在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中被降解。我們?yōu)榱瞬挥绊懯芫颜０l(fā)育，所以選擇分析兩個(gè)極體細(xì)胞的全基因組來(lái)推斷這個(gè)受精卵的全基因組是否正常。
不正常的第一種情況是染色體拷貝數(shù)不正常。 原因是細(xì)胞分裂時(shí)染色體分裂異常，即使父母完全健康。這種染色體不正常會(huì)導(dǎo)致生殖障礙或者唐氏綜合癥等遺傳疾病。
還有一種情況，如果父親或母親的基因有點(diǎn)突變，導(dǎo)致嚴(yán)重的遺傳疾病，它們也會(huì)傳給下一代。如果發(fā)生突變的基因只在極體內(nèi)，受精卵沒(méi)有點(diǎn)突變，那就沒(méi)事;如果傳到了受精卵里，就會(huì)讓下一代患上遺傳疾病。
用MALBAC技術(shù)來(lái)進(jìn)行單細(xì)胞基因組擴(kuò)增，我們可以同時(shí)檢測(cè)并避免上述兩種情況，來(lái)提高生殖細(xì)胞健康發(fā)育的成功率，避免遺傳疾病發(fā)生。具體做法就是用激光打一個(gè)小洞，把毛細(xì)血管插進(jìn)去，吸出兩個(gè)極體細(xì)胞來(lái)測(cè)序。如果疾病遺傳自母親， 我們用這個(gè)辦法。如果疾病遺傳自父親，我們則在受精第5天時(shí)取1—3個(gè)囊胚細(xì)胞來(lái)測(cè)序。
2013年，喬院長(zhǎng)在北醫(yī)三院開(kāi)始了臨床實(shí)驗(yàn)，利用MALBAC技術(shù)進(jìn)行胚胎遺傳診斷。我們第一個(gè)病例，是一位患有遺傳性多發(fā)性軟骨瘤(HME)的男性患者，他從10歲開(kāi)始，幾乎每過(guò)兩三年就長(zhǎng)一個(gè)瘤子，所以他的身上充滿(mǎn)了金屬。這種病是由于名為EXT2的基因發(fā)生單堿基雜合缺失，造成移碼突變。與孟德?tīng)柾茰y(cè)豌豆遺傳類(lèi)似，他和正常女性生育的后代會(huì)有50%的概率患病。與豌豆實(shí)驗(yàn)不同的是，這是人命關(guān)天的事，不能出任何差錯(cuò)，所以我們特別需要MALBAC技術(shù)的精確性。
通過(guò)體外受精技術(shù)，共得到這對(duì)夫婦的18個(gè)胚胎，經(jīng)過(guò)致病突變位點(diǎn)檢測(cè)和染色體篩查，發(fā)現(xiàn)共有7個(gè)胚胎是既沒(méi)有點(diǎn)突變，也沒(méi)有染色體異常的，喬院長(zhǎng)從中選了第4號(hào)胚胎進(jìn)行移植。
2014年9月19日，世界首例MALBAC嬰兒誕生了，我們?nèi)タ催@個(gè)孩子的時(shí)候，她真是完美，她一聲都沒(méi)哭，一直沖我笑。
第二個(gè)病例是一位攜帶少汗型外胚層發(fā)育不良致病突變基因的女性，她和丈夫已經(jīng)有了一個(gè)遺傳了這種疾病的兒子，沒(méi)頭發(fā)、沒(méi)汗腺、沒(méi)牙齒，他們想要二胎生一個(gè)正常的孩子。此病的發(fā)病率是十萬(wàn)分之一，美國(guó)電影演員邁克爾?貝瑞曼(Michael Berryman)也患有這種病，他沒(méi)有毛發(fā)、汗腺和指甲，一直在呼吁醫(yī)學(xué)界對(duì)他這種遺傳病進(jìn)行研究。這個(gè)致病基因EDA1是在X染色體上，如果生男孩，患病的概率是1/2，如果生女孩不會(huì)發(fā)病，因?yàn)榕⒂袃蓚€(gè)X染色體，而致病基因EDA1是個(gè)隱性基因，但該女孩有1/2的概率攜帶這種致病基因。
通過(guò)試管嬰兒技術(shù)，共得到這對(duì)夫婦的5個(gè)胚胎，其中2個(gè)胚胎既不攜帶致病基因，也沒(méi)有染色體異常，喬院長(zhǎng)選了一個(gè)看上去最健康的移植。這個(gè)孩子于2014年11月30日出生，不但正常而且肯定不再會(huì)把該疾病傳給后代。
總結(jié)一下，MALBAC技術(shù)可以同時(shí)避免染色體不正常和非常嚴(yán)重的基因點(diǎn)突變導(dǎo)致的遺傳疾病，使得我們可以提高生殖的成功率，得到健康的后代。
想要孩子的朋友可能會(huì)想，我們能不能用這種技術(shù)來(lái)選擇一個(gè)胚胎，讓孩子擁有更漂亮更聰明的基因?首先，基因組學(xué)還沒(méi)有發(fā)展到這種程度，能夠讓我們非常了解哪個(gè)基因是控制長(zhǎng)相的，哪個(gè)基因是控制聰明程度的。那不是單基因的問(wèn)題，而是多基因的事情。我們現(xiàn)在做的，就是避免非常嚴(yán)重的遺傳疾病。目前世界上大概有7000多種單基因遺傳疾病，常見(jiàn)的有400多種。避免這類(lèi)遺傳疾病在倫理上是可以接受的。
能否在更廣泛的情況下使用這類(lèi)技術(shù)?比如是否應(yīng)該篩選掉得癌幾率高的BRAC1 基因，它導(dǎo)致癌癥的幾率是70%， 而不是100%， 我們能不能讓父母決定嬰兒以后的命運(yùn)?我認(rèn)為這不是我們科學(xué)家或者醫(yī)生能解決的問(wèn)題，整個(gè)社會(huì)應(yīng)該進(jìn)行倫理上的研究和討論。
MALBAC的第二個(gè)應(yīng)用是癌癥。在中國(guó)，癌癥的發(fā)病率、死亡率逐年上升。根據(jù)2012年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，中國(guó)每年新發(fā)癌癥病例約為312萬(wàn)例，中國(guó)人一生患癌概率高達(dá)22%，死于癌癥的概率為13%。
癌癥是由于基因組改變所引起的疾病，針對(duì)癌癥的很多重大課題都需要單細(xì)胞基因組學(xué)。首先是個(gè)體化治療，即靶向治療，就是要對(duì)癥下藥，通過(guò)測(cè)序找到基因組哪里出現(xiàn)了改變，現(xiàn)在很多新藥都是靶向治療。
癌癥難以治愈和高死亡率的罪魁禍?zhǔn)资悄[瘤的轉(zhuǎn)移。其機(jī)理是癌癥先出現(xiàn)在原發(fā)灶，然后通過(guò)血液循環(huán)擴(kuò)散到身體的其他器官。然而，癌癥病人血液中腫瘤細(xì)胞數(shù)量很少，一般只有幾個(gè)，傳統(tǒng)的研究手段往往基于大量細(xì)胞才能進(jìn)行分析。因此我們的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)就可以用到循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究上。對(duì)病人來(lái)說(shuō)，還有個(gè)好處就是抽血分析的檢查是無(wú)創(chuàng)的，不用做活檢。北大腫瘤醫(yī)院的王潔教授、BIOPIC的白凡教授，以及天津醫(yī)科大學(xué)的張寧等教授和我的實(shí)驗(yàn)室一起參與了這項(xiàng)工作。
我們?cè)谝粋€(gè)肺癌病人的幾毫升血液樣本中共找了8個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，對(duì)它們進(jìn)行基因測(cè)序，看到基因組不同位置點(diǎn)突變，這突變信息為個(gè)性化治療提供了重要依據(jù)。但是，這8個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單堿基突變存在異質(zhì)性——也就是說(shuō)每個(gè)細(xì)胞都不一樣，這樣對(duì)癌癥檢測(cè)意義不大。
我們同時(shí)也看到拷貝數(shù)的變化。正常體細(xì)胞里的基因拷貝數(shù)是2，癌細(xì)胞要高于或低于2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同一個(gè)肺癌病人的8個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高度一致的拷貝數(shù)變異模式。更有趣的是，不同病人的同種癌的基因拷貝數(shù)圖案也是一樣的，這就展現(xiàn)了一個(gè)好的前景。我們可以通過(guò)分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)圖案來(lái)推測(cè)癌癥類(lèi)型。最近我們跟張寧教授合作，又發(fā)現(xiàn)乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胃癌具有不同的基因拷貝圖案(如下圖)。所以，現(xiàn)在我們想利用這些發(fā)現(xiàn)做不需活檢的無(wú)創(chuàng)癌癥檢查，希望能多收集一些循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這樣也許能夠做到癌癥的早發(fā)現(xiàn)。
最后總結(jié)一下今天的講座。DNA是以單分子的形式存在于每個(gè)細(xì)胞中的。因此，基因組的變化是隨機(jī)的。這也使得單細(xì)胞和單分子水平上的檢測(cè)成為必需。單細(xì)胞基因組學(xué)是單分子技術(shù)與基因組學(xué)的交匯之處。在單細(xì)胞中測(cè)基因拷貝數(shù)以及單個(gè)點(diǎn)突變，現(xiàn)在不僅已成為可能，而且真正成為了一項(xiàng)日益重要的技術(shù)。
精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是個(gè)體化醫(yī)學(xué)的一個(gè)新提法，最早由美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬提出，大家對(duì)它有各種各樣的解釋。這個(gè)星期我參加了一個(gè)國(guó)內(nèi)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)專(zhuān)家的會(huì)議，會(huì)議給出了一個(gè)定義： 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是指在大樣本研究獲得疾病分子機(jī)制的知識(shí)體系基礎(chǔ)上，以生物醫(yī)學(xué)，特別是組學(xué)數(shù)據(jù)為依據(jù)，根據(jù)“患者個(gè)體”在基因型、表型、環(huán)境和生活方式等各方面的特異性，應(yīng)用現(xiàn)代遺傳學(xué)、分子影像學(xué)、生物信息學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等方法與手段，制定個(gè)性化精準(zhǔn)預(yù)防、精準(zhǔn)診斷和精準(zhǔn)治療的方案。
我們和喬杰院長(zhǎng)合作的工作是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的生動(dòng)案例，有什么比一個(gè)細(xì)胞更精細(xì)?比一個(gè)堿基更準(zhǔn)確?
單分子手段使得我們能夠在單個(gè)分子的層面上檢測(cè)、理解并改善生命過(guò)程。作為一個(gè)做基礎(chǔ)研究的科學(xué)家，我熱愛(ài)我的研究工作。科學(xué)家都希望研究成果能夠造福人類(lèi)，但是基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用是非常不容易的。我感到自己非常幸運(yùn)，有機(jī)會(huì)與喬院長(zhǎng)的團(tuán)隊(duì)合作，使我們的科學(xué)工作能夠?yàn)橛羞z傳疾病的家庭帶來(lái)福音，我感到由衷的高興。
我感謝我現(xiàn)在哈佛和BIOPIC的團(tuán)隊(duì)，以前的研究生和博士后，以及我的合作者們，BIOPIC的同事們。沒(méi)有他們的努力，我今天講不出這樣的故事。（來(lái)源：賽科學(xué)）
